沉香树果皮不同熟化时期的挥发性成分研究_中国永发沉香树种植基地

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沉香树果皮不同熟化时期的挥发性成分研究
2019-06-16 15:37
  
 
  白木香(国内沉香树)为瑞香科(Thymelaeaceae)沉香属热带及亚热带常绿乔木,为中国特有的珍稀濒危药源植物,其含树脂的干燥木材作为国产沉香使用。沉香在传统医药、宗教、香料领域用途广泛,但其形成速度极为缓慢,导致野生资源被过度砍伐。近年来,白木香人工种植面积逐渐增加,如何实现白木香非药用部位的开发与可持续利用对推动沉香行业发展具有重要意义。目前,人工种植的白木香沉香树林每年可生产大量果实,其果皮具有特殊香味,研究表明白木香果皮含有葫芦素型四环三萜、黄酮、甾醇及沉香特征性成分倍半萜等成分,具有抗肿瘤及抗菌等活性。本课题组通过前期白木香基地调研,发现熟化后白木香果皮具有类似沉香的气味。研究表明,陈皮在熟化(又称陈化)过程中挥发油组分发生很大改变,然而关于白木香果皮熟化方面的研究及应用未见报道。本研究首次报道白木香果皮6个不同熟化时期挥发性成分的差异,为全面合理开发白木香非药用部位奠定理论基础。
 
一、材料与仪器
 
  白木香果实采自广东省东莞市白木香基地,根据果皮不同的熟化时期分为Ⅰ期(新鲜采摘期)、Ⅱ期(30℃,湿度 30%,放入密闭容器熟化 48 h)、Ⅲ期(30℃,湿度 30%,放入密闭容器熟化 96 h)、Ⅳ期(30℃,湿度 30%,放入密闭容器熟化 144 h)、Ⅴ期(30℃,湿度 30%,放入密闭容器熟化 15 d)和Ⅵ期(30℃,3湿度 30%,放入密闭容器熟化 20 d)(图 1),每个时期 6 批样品。去除果实内的沉香种子,果皮冷冻干燥后打粉备用。
 
  TRACE 1310/TSQ 8000 型气相色谱质谱联用仪(美国 Thermo 公司);石英毛细管柱(TG-5 MS,30 m×0。25 mm×0。25 ?m,美国 Thermo 公司);万分之一天平(瑞士梅特勒斯公司);SB-800 DTD 型超声波清洗仪(宁波新芝生物科技股份有限公司);球磨仪(MM 400 混合型球磨仪,Retsch 公司);乙酸乙酯为分析纯。
 
 
二、方法
 
  2.1 供试品溶液的制备
 
  精密称取果皮粉末 0.1 g,置于 2 mL 离心管中,精密加入乙酸乙酯 1.5 mL,密封管口,样品于室温下浸泡过夜;超声(40 kHz)冷提 45 min,12000 r·min -1 ,离心 10 min,称重,加乙酸乙酯补足失重,取上清液置于新的离心管中,氮吹浓缩至溶剂挥干,精密加入乙酸乙酯 200 ?L,充分震荡混匀后用 0.22 ?m 聚四氟乙烯(PTFE)滤膜滤过,得续滤液,即供试品溶液,4 ℃储存,备用。
 
  2.2 GC-MS 条件
 
  GC条件在前人基础上优化 [11] ,色谱柱为 TG-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 ?m)石英毛细管柱。进样口温度为 250 ℃,不分流;载气为高纯度氦气(纯度≥99.999%),柱流量 N 2 ,进样量 1 mL·min -1 。升温程序:从 50 ℃从开始以10 ℃·min-1升到 155 ℃,保留 15 min;再以 8 ℃·min-1升到 280 ℃,保留 10 min。
 
  MS 条件:离子源为 EI 源,电离电压 70 eV,离子源温度 250 ℃,质量扫描范围 m/z 为 50~500。
 
  2.3 数据统计分析样品总离子流图导入赛默飞 GC-MS Trace Finder 3.3 软件,在与 NIST 2.2 质4谱库比对结果中,当色谱峰强度>1×10 5 ,质谱图与 NIST 质谱库的质谱图正向比对结果大于 500 的峰确定为所鉴别的物质。自动质谱解卷积和识别系统(AMDIS)软件用于自动去卷积后分析色谱峰的纯度和保留时间-特征离子列表的获取,根据该软件提取峰面积 [12] 。本研究采用主成分分析(PCA),在建模前,对数据进行 pareto 预处理,之后通过 SIMCA 14.1 软件进行分析。
 
三、结果
 
  3.1 不同熟化时期白木香果皮化学成分分类应用 GC-MS 技术对各样品成分进行分析,通过 Trace Finder 3.3 工作站处理样品总离子流图,清除背景及图谱重叠的干扰,结合 NIST 2.2 数据库标准信息比对,对色谱峰进行鉴定,并采用峰面积归一化法计算各化合物的相对百分含量。
 
  分析结果显示,不同熟化时期共比对出 207 种化合物,包括单萜 5 个、倍半萜16 个、二萜 2 个、三萜 2 个、甾体 14 个、类萜 4 个、生物碱 15 个、脂肪酸 46个、烷烃 60 个、烯烃 4 个及其他类化合物 39 个,其中烷烃与脂肪酸在果皮中的种类与含量最高,与前人报道一致 [8,13] 。对六个阶段不同成分的含量比例进行分析(图 3),结果表明,单萜、三萜在未熟化前(I 期、II 期)含量低于检测限,而随着熟化时间增加,单萜与三萜含量先上升后下降;甾体成分在 II 期产生,在 VI 期含量最高,分析发现甾体成分最后时期主要增加的是麦角甾醇,可能与陈化后期微生物代谢物增加有关;倍半萜在未熟化前(I 期)含量极低,而随着熟化时间增加,含量逐渐增加,在熟化 96 h 后含量最高(III 期),之后下降;类萜则在熟化后 144 h 后含量较低(IV 期、V 期、VI 期,百分含量<0。11%)。以上结果均表明,在果皮熟化过程,化学成分的组成与含量发生明显变化,其中萜类相关的代谢变化突出,而沉香中最重要的成分之一为倍半萜,因此作者有必要对以上萜类成分进行进一步分析。
 
  3.2 不同熟化时期果皮中萜类及沉香特征性成分分析由于白木香果皮熟化过程中萜类代谢变化显着,作者对其中的五类成分进一步分析。结果表明,倍半萜、单萜分别随着熟化程度增加含量升高,到III期含量最多;而类萜则在III期后含量极速下降;三萜仅在IV期能检测到,其他时期都在检测限下;甾体类成分在最后熟化VI期含量最高,其中麦角甾醇含量高达8.45%,可能与熟化后期微生物代谢有关。该实验检测到的类萜成分为角鲨烯、 α -生育酚、 γ -生育酚、g-生育酚;角鲨烯是合成三萜和甾体的重要前体,随着熟化过程的进行,角鲨烯含量先升高后下降,表明熟化促进萜类代谢途径上游通路产生角鲨烯,而后随着下游三萜与甾醇形成,角鲨烯不断被消耗,至 IV 期后其含量下降;生育酚为重要的抗氧化剂,在 I、II 期含量较多,III、IV 期含量下降直至检测限下,表明熟化后期过氧化程度增加,而过氧化可以激活沉香萜类代谢等。
 
  倍半萜类化合物是沉香特征性成分之一,在不同熟化时期中共检出 16 种倍半萜类成分。I 期倍半萜含量极低,主要为桉叶烷型倍半萜;II 期到 IV 含量较 I 期显着性增加,倍半萜种类更加丰富,除了桉叶烷型倍半萜外还增加了愈创木烯型和螺旋烷型倍半萜,倍半萜的种类及含量在 III 期最多,而后下降。
 
  3.3 主成分分析
 
  采用主成分分析(PCA)法分析不同熟化时期的白木香果皮成分,将各化合物相对含量的数据矩阵归一化处理后导入 SIMCA 14。1 软件中进行 PCA-X 判别分析,结果如原来图片所示。在建立模型时,拟合参数 Q 2 (cum)=0。791,R 2 X(cum)=0。875,当 Q 2 >0。5 与 R 2 X 接近 1 时,表示白木香果皮不同熟化时期挥发性成分分离效果好。当熟化时间超过 2 d 后(III、IV、V、VI 期),白木香果皮的成分结构发生明显变化,尤其超过 10 d 后(V、VI 期),白木香果皮中成分发生了显着变化。
 
  进一步分析前 4 个时期的化学成分特征,我们又建立了这 4 个时期化学成分的 PCA 图,发现Ⅲ、Ⅳ期与其他熟化时期明显分开,化学成分发生显着改变,I期和 II 期成分变化较小;在建立模型时,拟合参数 Q 2 (cum)=0.69,R 2 X(cum)=0.805,当 Q 2 >0.5 与 R 2 X 接近 1 时,表示分离效果好。
 
四、讨论
 
  白木香结香部位主要有倍半萜类化合物、2-(2-苯乙基)色酮、芳香族化合物、三萜类化合物等 [15-17] 。本研究发现,熟化后白木香果实中存在大量萜类成分,但种类、数目分布因熟化时间不同而有所差异。倍半萜、单萜、三萜分别随着熟化程度增加含量先升高后降低,而类萜则在 III 期后含量极速下降。进一步对沉香特征性成分倍半萜进行分析,发现沉香螺醇、β-桉叶烯、β-桉叶醇等均在新鲜期含量低于检测限,而熟化 II-IV 期含量均显着增加;个别倍半萜如 α-愈创木烯仅在Ⅱ期时被检测到,之后含量均在检测限下,该成分可能是其他倍半萜的前体。
 
  PCA 分析结果表明,V、VI 期的白木香果壳成分发生明显变化,可能因熟化后期微生物增多有关;在前 4 个时期中,Ⅰ、Ⅱ期与Ⅲ、Ⅳ期的白木香果壳成分可明显区分,说明熟化 48 h 后白木香果壳的代谢流发生明显改变。研究结果表明,白木香果皮熟化 96 h 所含沉香特征性成分的种类与含量最丰富,可在此条件基础上进行进一步优化与开发。
 
  此外,在临床上白木香果壳提取物具有清除 DPPH 自由基、抑制络氨酸酶活性的作用,这可能与白木香果壳富含维生素 E(生育酚)有关;而在香精与香料行业中,白木香果壳中的辛酸、肉豆蔻酸与水杨酸苄酯等脂质类成分经过加工可制成香料,如人造食用香精或花香香料。本研究结果则提示,不同熟化程9度的果皮成分变化较大,可根据后期提取目的不同,选择不同熟化程度的白木香果皮,为全面合理开发白木香非药用部位实现白木香的可持续利用奠定基础。

 
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